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雙染法免疫熒光組織化學染色步驟

更新時間:2023-08-08      點擊次數:3430

如果同一標本中需要同時顯示A、B兩種抗原,則A抗原的抗體用FITC標記,B抗原的抗體用TRITC標記,可采用以下染色方法用過的:

免疫熒光細胞化學雙染

原代培養(yǎng)的大鼠端腦細胞第14天胚胎:在成骨形態(tài)蛋白的誘導下,乙酰膽堿轉移酶(綠色熒光)和同源結構域蛋白Islet-1(紅色熒光)共存于細胞質中(激光掃描共存)。聚焦顯微鏡觀察)

1.一步雙染法,將兩種熒光標記抗體按適當比例(A+B)混合,按照直接法進行染色。

2.兩步雙染法,先用TRITC標記的抗體A進行免疫熒光染色,然后用FITC標記的抗體B進行免疫熒光染色。根據兩種抗體的動物種類,可以采用直接法或間接法結果是A抗原呈橙紅色熒光,而B抗原呈黃綠色熒光。在應用中,常用的方法是免疫熒光組織化學中的間接法與熒光染料SABC-Cy3法的結合。例如,在實驗設計中,選擇小鼠抗大鼠A和兔抗大鼠B作為兩種不同的特異性一抗,匹配的二抗分別為FITC-抗小鼠IgG和生物素化抗兔。免疫球蛋白G。

進行雙染時,由于兩種一抗來源不同,可能會混合一抗。孵育后,清洗未結合的一抗。滴加二抗時,先加入人生物素化抗兔IgG(二抗)孵育。清洗后,滴下 SABC-Cy3 復合物。特異性熒光,然后與FITC-抗小鼠IgG(二抗)孵育,最后封片觀察。結果,A抗原顯示綠色熒光,B抗原顯示紅色熒光。

該方法中需要注意的是,兩種一抗混合稀釋時,抗體的終濃度應為每種抗體的工作濃度。也就是說,混合液要同時滿足兩種一抗的工作濃度。如果兩個一抗來自同一物種,則必須進行兩次雙染,即A抗原先用第一個一抗和第一個熒光二抗染色,然后用第二個一抗和第一個熒光二抗洗滌熒光二抗。 B抗原染色需使用兩種熒光二抗,否則會發(fā)生交叉反應,導致染色不特異。


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