品牌 其他品牌 貨號 FP-201-425 供貨周期 現(xiàn)貨 應(yīng)用領(lǐng)域 醫(yī)療衛(wèi)生,化工,生物產(chǎn)業(yè),制藥
jenabioscience:Atto 425蛋白質(zhì)標(biāo)記試劑盒 Jena Bioscience由Max-Planck-Institute of Molecular Physiology(Dortmund)的一組科學(xué)家于1998年成立，利用超過25年的學(xué)術(shù)知識為100多個國家的研究和行業(yè)客戶開發(fā)創(chuàng)新試劑。
供一般實驗室使用。
運輸: 凝膠包裝運輸
儲存條件: 儲存在-20°C 避光儲存，參見手冊
保質(zhì)期: 12個月
光譜特性: 激發(fā)最大值:λ exc = 436納米發(fā)射最大值:λ 全身長的 = 484納米消光系數(shù):ε 最大 = 45000摩爾 -1 厘米 -1 校正系數(shù):CF 280納米 = 0.23
描述: 熒光技術(shù)已經(jīng)成為生物科學(xué)的主要工具。熒光蛋白如GFP和DsRed融合到感興趣的蛋白(POI)允許表達(dá)分析和體內(nèi)蛋白定位。然而，由于這些融合蛋白的大分子量，它們的應(yīng)用受到限制。此外，相關(guān)的分子生物學(xué)是乏味和耗時的。 共價連接到POI上的小熒光團(tuán)可能有助于克服這個問題。半胱氨酸巰基的熒光標(biāo)記對于研究POI的結(jié)構(gòu)、功能和相互作用是優(yōu)選的。(請注意:Jena Bioscience提供了一個即用型試劑盒，用于用高質(zhì)量的小熒光團(tuán)標(biāo)記半胱氨酸殘基(Cat。# FP-202)用于蛋白質(zhì)活性和功能研究)。 然而，最常見的蛋白質(zhì)標(biāo)記方法是胺修飾。胺反應(yīng)性熒光團(tuán)如NHS-酯容易與N-末端[1]以及賴氨酸側(cè)鏈上的伯氨基反應(yīng)，形成穩(wěn)定的共價鍵。 這種Jena Bioscience蛋白質(zhì)標(biāo)記試劑盒設(shè)計用于用小熒光團(tuán)標(biāo)記POI的賴氨酸，產(chǎn)生熒光蛋白質(zhì)-熒光團(tuán)綴合物。它包含對1mg POI進(jìn)行10次單獨標(biāo)記反應(yīng)所需的所有試劑。
內(nèi)容: 1瓶含1毫克
二甲基甲酰胺 200微升
碳酸氫鈉 1瓶含84毫克
超純水 1毫升
儲存和穩(wěn)定性: 收到后，將染料儲存在-20°c下。其他成分可儲存在室溫下。如果按照建議儲存，Jena Bioscience保證該產(chǎn)品在12個月內(nèi)保持最佳性能。
協(xié)議: 最佳蛋白質(zhì)濃度為10 mg/ml，其他濃度也是可能的，然而，它應(yīng)該至少為2 mg/ml，因為標(biāo)記效率受到較低蛋白質(zhì)濃度的影響。我們建議每個標(biāo)記反應(yīng)使用大約1毫克蛋白質(zhì)。 含有伯胺如Tris和甘氨酸的緩沖液不適用于標(biāo)記反應(yīng)，必須在開始標(biāo)記反應(yīng)前用合適的不含胺的緩沖液如PBS、MES或HEPES替換。
實驗協(xié)議
加入1毫升超純水溶解碳酸氫鈉。得到的1 M溶液在4°C下至少穩(wěn)定2周。 向蛋白質(zhì)溶液中加入適量的碳酸氫鈉(1 M ),使最終濃度達(dá)到100 mM 通過添加100 μl DMF制備染料，使染料濃度達(dá)到10 mg/ml。渦旋直至NHS酯*全 將100微升蛋白質(zhì)溶液(10毫克/毫升)和10微升染料(10毫克/毫升)加入適當(dāng)?shù)男∑恐?。小心渦旋并短暫離心，收集試管底部的反應(yīng)混合物。 室溫下在搖床中培養(yǎng)一小時。避光！ 使用標(biāo)準(zhǔn)凝膠過濾柱如Sephadex G-25或類似物純化綴合物?；蛘?，可以通過透析或合適的自旋濃縮器將游離染料從綴合物中分離出來。 請注意，該套件不提供蛋白質(zhì)純化材料！
共軛物的濃度 因為在標(biāo)記過程中，特別是在純化過程中，可能會發(fā)生一定的蛋白質(zhì)損失，所以測量綴合物的濃度對于進(jìn)一步的應(yīng)用是重要的。蛋白質(zhì)的濃度通常通過測量其在280 nm處的吸光度來確定。然而，如Atto 425的激發(fā)光譜所示，熒光染料也在280 nm處吸收，從而增加了λ 280 對于共軛。因此，需要一個校正系數(shù)(CF)來消除280 nm處染料的影響。 每種染料的CF在光譜數(shù)據(jù)部分給出，因此綴合物的濃度根據(jù)下式計算:
c(毫克/毫升)= ((A 280 ［構(gòu)成動植物的古名或拉丁化的現(xiàn)代名］ 最大 x CF) / ε 280 )x MW 蛋白質(zhì)
A280 在280 nm處測量的共軛溶液的吸光度 A 最大 在λ處測量的共軛溶液的吸光度 exc λ exc , ε 最大 ，CF Atto染料的內(nèi)在性質(zhì)，請參考光譜專題 ε280 ，MW 蛋白質(zhì)的內(nèi)在特性，如果不知道，可以從網(wǎng)上獲得，如ExPASy Proteomics Server[2]
標(biāo)記度 DOL表示每分子綴合物中熒光團(tuán)分子的平均數(shù)。它是共軛物的一個重要參數(shù)，顯著地影響進(jìn)一步的應(yīng)用。對于大多數(shù)目的，每200個氨基酸大約1個熒光團(tuán)分子的DOL是理想的，也參見故障排除部分。 DOL的計算公式如下:
DOL = (A 最大 x ε 280 )/ ((A 280 ［構(gòu)成動植物的古名或拉丁化的現(xiàn)代名］ 最大 x CF) x ε 最大 )
測定用Atto 488 NHS酯標(biāo)記的BSA(牛血清白蛋白)的結(jié)合物濃度和DOL的實例: 牛血清白蛋白:ε 280 = 42925米 -1 厘米 -1 ，MW = 66，433 Da Atto 488: λ exc = 501納米，ε 最大 = 90，000米 -1 厘米 -1 ，CF = 0.1
標(biāo)記和純化后，分別在280和501 nm測量結(jié)合物溶液的吸收。
計算綴合物濃度和DOL:
c(毫克/毫升)= ((A 280 ［構(gòu)成動植物的古名或拉丁化的現(xiàn)代名］ 最大 x CF) / ε 280 )x MW 蛋白質(zhì) c(毫克/毫升)=((1.69-7.23 x 0.1)/42925)x 66433 c(毫克/毫升)= 1.5
DOL = (A 最大 x ε 280 )/ ((A 280 ［構(gòu)成動植物的古名或拉丁化的現(xiàn)代名］ 最大 x CF) x ε 最大 ) DOL =(7.23 x 42925)/((1.69-7.23 x 0.1)x 90000) DOL = 3.57
在該實驗中，綴合物的濃度為1.5 mg/ml，大多數(shù)蛋白質(zhì)分子用三個或四個Atto 488分子標(biāo)記，相當(dāng)于每200個氨基酸有1.2個Atto 488分子。 請注意，結(jié)合物的濃度和DOL的光譜測定不是絕對正確的。游離染料的光譜特征與結(jié)合到POI的染料的光譜特征不全 一般來說，這些變化小得可以忽略不計，因此，光譜測定結(jié)合物的濃度和DOL是*常用 除了光譜測量之外，可以通過SDS-PAGE和隨后的凝膠熒光掃描來分析綴合物。在熒光掃描中應(yīng)該只有一條帶(由熒光標(biāo)記的蛋白質(zhì)組成)可見。如果在非常低的分子量下有一個額外的帶，結(jié)合物溶液仍然含有游離染料，必須再次純化。
結(jié)合物的儲存 避光！像未標(biāo)記的蛋白質(zhì)一樣儲存結(jié)合物。我們建議將溶液分成小份，并在-20°C或-80°C下冷凍。避免反復(fù)冷凍和解凍！
故障排除:
蛋白質(zhì)溶液的濃度
該分析被優(yōu)化用于標(biāo)記濃度為10 mg/ml的1 mg蛋白質(zhì)。
蛋白質(zhì)濃度高于10毫克/毫升時，按比例增加染料量。如果您的蛋白質(zhì)濃度非常低(< 1毫克/毫升)，請使用旋轉(zhuǎn)濃縮器以達(dá)到2毫克/毫升的最終濃度。
標(biāo)記的效率強烈依賴于濃度，并且在不同的蛋白質(zhì)之間有所不同。因此，在每一種情況下，優(yōu)化可能是必要的，以獲得所需程度的標(biāo)記。 緩沖成分
含有伯胺(甚至微量)的蛋白質(zhì)溶液會顯著降低標(biāo)記效率。確保你的蛋白質(zhì)被充分透析，以防它與含胺物質(zhì)接觸。 pH值的影響
檢查你的蛋白質(zhì)溶液的pH值！參考范圍是8.2 - 8.5。
蛋白質(zhì)的伯氨基不能被質(zhì)子化而具有活性，因此，蛋白質(zhì)溶液的pH值必須足夠高。另一方面，NHS酯的水解速率隨著溶液的pH值而增加，導(dǎo)致非活性染料。最佳標(biāo)記結(jié)果在pH 8.3獲得。
在pH值較低的強緩沖蛋白質(zhì)溶液中，100 mM碳酸氫鈉可能不足以將pH值提高到最佳值。您可以添加更多的碳酸氫鈉，直到達(dá)到最佳pH值。 注意，標(biāo)記效率不僅取決于周圍條件，還取決于蛋白質(zhì)特性。蛋白質(zhì)表面的三級結(jié)構(gòu)和由此產(chǎn)生的賴氨酸數(shù)量以及等電點和蛋白質(zhì)在pH 8.3下的行為起作用。
過度標(biāo)注 過度標(biāo)記的原因可能是蛋白質(zhì)表面的大量賴氨酸和/或蛋白質(zhì)在pH 8.3時的最佳特性。 為了防止過度標(biāo)記，減少染料量或增加蛋白質(zhì)濃度。你也可以減少反應(yīng)時間。
綴合物的純化 染料在水溶液中是不穩(wěn)定的NHS酯的水解速率隨著溶液的pH值而增加。因此，在每次標(biāo)記反應(yīng)中都會產(chǎn)生一定量的游離染料，需要從綴合物中分離出來。 如果純化后的結(jié)合物仍然含有微量的游離染料，將其用于第二步純化。通過SDS-PAGE檢查結(jié)合物的純度。 在游離染料濃度較高時，從綴合物中分離游離染料變得更加困難。濃度非常高時，色譜柱或膜甚至?xí)蝗玖隙氯?，因此?yīng)盡量優(yōu)化標(biāo)記反應(yīng)，以降低游離染料的濃度。請記住，總收率受到額外純化步驟的影響。
什么樣的DOL是優(yōu) 作為一個基本規(guī)則，每200個氨基酸一種染料是理想的，然而，最佳的標(biāo)記程度取決于你的蛋白質(zhì)以及你的預(yù)期應(yīng)用。如果您不確定，請使用不同劑量的少量結(jié)合物檢查您的分析，以獲得最佳結(jié)果。 在任何情況下都要防止過度標(biāo)記，因為這可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集或相鄰染料的熒光猝滅。
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產(chǎn)品型號：FP-201-425
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